| Caracterização da atividade da adenosina desaminase em linfócitos e plaquetas humanos |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
01/03/2019 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
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| Banca |
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Giovana Cristina Giannesi
- Jeandre Augusto Otsubo Jaques
- Luciane Candeloro
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| Resumo |
A conversão da adenosina em inosina é catalisada pela enzima adenosina
desaminase (E-ADA; EC 3.5.4.4), que possui duas isoformas em humanos e pertence
à família das hidrolases dependentes de zinco. A E-ADA pode modular a função dos
linfócitos, desempenhando também importante papel no desenvolvimento de tecidos,
e na função das plaquetas, devido a sua interferência no processo de angiogênese e
agregação plaquetária. A quantificação da atividade da E-ADA em linfócitos e
plaquetas humanos já foi previamente realizada, porém não há na literatura estudos
apresentando a sua caracterização bioquímica e cinética detalhada. Assim,
evidenciou-se a necessidade de caracterização da atividade da E-ADA em linfócitos
e plaquetas isolados de sangue periférico de humanos, na ausência de processos
patológicos envolvidos. Antes do início da caracterização enzimática foi realizado
ensaio de viabilidade das células mononucleadas (PBMC) ricas em linfócitos, que
apresentou 88,4% de células com membrana íntegra após 20 horas. Na citometria de
fluxo, observou-se que 53,8 ± 6,8% de células do PBMC no gate dos linfócitos foram
marcadas com o anticorpo anti-CD26. Nos linfócitos, a atividade enzimática foi linear
de 15 a 120 minutos de incubação, com 2,5 a 12,5 µg de conteúdo de proteína e entre
a faixa de pH 6.0 a 7.4. Já nas plaquetas, a atividade foi linear de 15 a 105 minutos
de incubação, com 7,5 a 20 µg de conteúdo de proteína e entre a faixa de pH 6.0 a
7.4. Para linfócitos, o Km aparente e Vmax foram 0,103 ± 0,051 mM e 0,025 ± 0,001
nmol de NH3/min/mg de proteína, respectivamente. Para plaquetas, o Km aparente foi
0,0017 ± 0,00045 mM e a Vmax foi 0,004 ± 0,0001 nmol de NH3/min/mg de proteína. O
zinco (5 mM) exerceu inibição na atividade enzimática em ambas as células, porém o
efeito preventivo do EDTA foi observado apenas nos linfócitos. A E-ADA nos linfócitos
apresentou preferência pela adenosina como substrato em relação à 2’-
desoxiadenosina e guanosina, enquanto que nas plaquetas observou-se preferência
pela adenosina apenas quando comparada à guanosina. O EHNA apresentou inibição
significativa da atividade da E-ADA nos linfócitos e nas plaquetas (>90%),
demonstrando a predominância da isoforma ADA1 nestas células. |
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| O uso de ferramentas computacionais na busca de novos peptídeos com atividade antimicrobiana |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
06/02/2019 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Maria Ligia Rodrigues Macedo
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
- Luís Henrique de Oliveira Almeida
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| Banca |
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Maria Ligia Rodrigues Macedo
- Simone Maria Neto
- Suzy Wider Machado
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| Resumo |
Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são uma nova classe de substâncias com capacidade de eliminar microrganismos patológicos e possuem um amplo espectro de atividade. Essas moléculas são obtidas de fontes naturais, mas também podem ser sintetizadas em laboratórios com o auxílio da tecnologia, economizando tempo e recursos financeiros ou humanos. Esse trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de um PAM de cadeia curta com atividade antimicrobiana comprovado em experimentos in vitro. A partir de uma proteína denominada ApTI, um inibidor de tripsinas de Adenanthera pavonina, foram obtidos peptídeos com dezoito resíduos de aminoácidos através da clivagem in silico da cadeia de aminoácidos pelo software CAMPR3. Posteriormente, a sequência com as melhores predições para peptídeo antimicrobiano foi analisada no APD3 Databse. A roda helicoidal, gerada pelo software Helical foi utilizada para verificar o caráter anfipático das moléculas e, assim, fazer as devidas modificações estruturais com intuito de obter uma molécula com potencial atividade antimicrobiana. A modelagem Ab initio foi feita utilizando o software I-TASSER e validada pelo software PROCHECK. Dentre os peptídeos obtidos foi escolhido o que apresentou maior probabilidade de ser antimicrobiano, onde as modificações na sequência original resultaram no peptídeo denominado Adepamicina, com tendência a formar α-hélice de caráter anfipático apresentando características com melhor potencial de um PAM, quando comparado a estrutura de origem, e homologia com outros PAMs. Para comprovação da ação antimicrobiana foram feitos ensaios de atividade antimicrobiana in vitro, obtendo a concentração inibitória mínima (CIM) para as bactérias Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, seguindo o protocolo M2-A8 disponível pela Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), assim como outros ensaios biológicos que comprovassem a eficácia do peptídeo, como o ensaio hemolítico, onde foi comprovado que em baixíssimas concentrações o peptídeo não compromete células eucarióticas. Uma breve investigação do mecanismo de ação de Adepamicina frente Escherichia coli foi determinado, sendo este o modelo bacteriano escolhido pois apresentou a menor CIM, 0,9 μM. |
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| AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE LIPASE A PARTIR DO CONSUMO DE GLICEROL INDUSTRIAL POR FUNGOS FILAMENTOSOS: PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO MELHOR PRODUTOR |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
03/08/2018 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Giovana Cristina Giannesi
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
- John Dayvan Maidana Serpa
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| Banca |
- Douglas Chodi Masui
- Edson dos Anjos dos Santos
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Giovana Cristina Giannesi
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| Resumo |
Lipases (EC 3.1.1.3) são acilhidrolases que catalisam a hidrólise e síntese de ésteres formados de glicerol e ácidos graxos e apresentam a capacidade de hidrolisar substratos hidrofóbicos em meio hidrofílico na interface lipídio-água. As lipases de aplicação industrial são preferencialmente obtidas de microrganismos como, Penicillium, Acremonium e Aspergillus, podendo ser empregadas em: processamento de óleos e gorduras, formulação de detergentes, síntese de fármacos e produção de biodiesel. Com relação à produção de biocombustíveis, o emprego de lipases de microrganismos substitui a hidrólise alcalina e facilita a recuperação do glicerol formado como subproduto. O glicerol pode ser usado nos setores alimentícios, cosmético, produção de papel, tecidos e tintas e, mais recentemente, vem sendo empregado no crescimento microbiano. O objetivo desse trabalho é avaliar a produção de lipase a partir do consumo de glicerol industrial por fungos filamentosos, purificar e caracterizar a enzima do melhor produtor. Na produção de lipase, S. strictum apresentou maior produção enzimática (3,13 U/mg) em glicerol industrial seguido de óleo de girassol (2,63 U/mg), enquanto Penicillium solitum teve a maior produção enzimática em azeite de oliva (0,48 U/mg), ambos em 168 h de crescimento em agitação constante (110 rpm). O pH ótimo das lipases de S. strictum e P. solitum foi 5,0, enquanto a lipase de S. strictum manteve-se estável por 120 min com 100 % de atividade, a de P. solitum foi estável pelo mesmo período em pH 7,0 e 8,0. A lipase de S. strictum foi purificada usando três colunas cromatográficas (DEAE-celulose, Sephacryl S-200 e Octyl-sepharose) com fator final de purificação de 24,4 vezes e rendimento de 16,1 %. A lipase purificada de S. strictum foi estável na presença de surfactante e detergentes (goma arábica, Triton™ X-100, TWEEN® 20 e TWEEN® 80); porém, mantendo entre zero e 4,72 % de atividade na presença de SDS. A lipase também foi estável na presença de metanol (80 %), DMSO e acetona (60 %); entretanto, apresentou atividade abaixo de 50 % nos demais solventes orgânicos (etanol, isopropanol, n-butanol e acetonitrila). A enzima exibiu atividade sobre p-NPP, p-NPM e p-NPO com atividade específica de 2,82, 4,09 e 8,71 U/mg, respectivamente. O teste de reuso da lipase imobilizada em alginato de sódio mostrou retenção de 70 % de atividade no segundo ciclo e 30 % no terceiro. As melhores concentrações de glicerol industrial usado como fonte de carbono foram: 0,5; 1; 2; 4 e 6 % para P. solitum e S. strictum. O uso do glicerol industrial como fonte de carbono para a produção de lipase pelo S. strictum mostrou-se uma alternativa viável, econômica e eco-amigável. Além disso, revelou a possibilidade para novas investigações em aplicações industriais, principalmente no setor de conversão do glicerol em produtos de valor econômico agregado. |
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| Síntese de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) a partir de glicerol por fungos filamentosos |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
08/06/2018 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
- Luís Henrique Camargo Costa
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| Banca |
- Denis Pires de Lima
- Edson dos Anjos dos Santos
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Maria Rita Marques
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| Resumo |
Em função da crescente busca por biocombustíveis, a produção de biodiesel tende a aumentar gerando uma preocupação com o seu principal subproduto: o glicerol. Devido ao baixo valor comercial e o potencial impacto ambiental negativo, atribuído à superprodução do glicerol, torna-se fundamental encontrar formas alternativas de conversão deste subproduto em produtos com maior valor agregado. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo selecionar fungos endofíticos isolados de Aspilia grazielae (Santos) com potencial para produção de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) utilizando o glicerol como substrato. Cinquenta e uma cepas isoladas da planta, sendo 18 do gênero Aspergillus spp.; 13 do gênero Colletotrichum spp.; 10 do gênero Penicillium spp. e 10 do gênero Fusarium spp. foram submetidas a testes de pré-seleção. Destas cepas, Aspergillus sp. (FF5), Aspergillus sp. (FF3) e Penicillium sp. (BR10) foram capazes de produzir lipídios utilizando glicerol como fonte de carbono. O perfil dos ácidos graxos foi determinado pela análise de CG/MS, onde foi possível detectar os ácidos graxos majoritários: linolênico (C18:3) e linoleico (C18:2), correspondendo a 90,04 % produzidos pela cepa Aspergillus spp.(FF5), 89,61 % produzidos por Aspergillus spp.(FF3) e 75,69 % produzidos por Penicillium spp. (BR10). A utilização do glicerol como fonte de carbono para produção de ácidos graxos poli–insaturados (PUFAs) através de ensaios de biotransformação deve ser considerada uma alternativa plausível para absorver e agregar valor ao excedente deste composto proveniente da indústria de biocombustíveis. |
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| Efeitos de compostos citotóxicos de lauráceas na indução de apoptose e na expressão de genes em células neoplásicas in vitro |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
18/05/2018 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Maria de Fatima Cepa Matos
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
- Kamylla Fernanda Souza de Souza
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| Banca |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
- Caio Fernando Ramalho de Oliveira
- Maria de Fatima Cepa Matos
- Priscila de Matos Candido Bacani
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| Resumo |
Mezilaurus crassiramea e Aniba heringeri (Lauraceae), plantas encontradas no Cerrado de Mato Grosso do Sul, foram estudadas quanto à citotoxicidade em células neoplásicas, devido à demanda por estudos relacionados ao tratamento de câncer. O estudo guiado dos extratos e fases levou ao isolamento de dois compostos: majoranolídeo (butanolídeo) e dímero de desidrogoniotalamina (estiril-pirona), os quais apresentaram forte atividade citotóxica para as linhagens de leucemia promielocítica aguda (HL-60) e de carcinoma de mama triplo-negativo (MDA-MB-231), respectivamente, tornando-se relevante a avaliação dos efeitos que levaram à citotoxicidade nessas linhagens. O objetivo do trabalho foi investigar efeitos apoptóticos e o perfil de expressão de genes integrantes das vias intrínseca (BAX e BCL-2) e extrínseca (caspase-8) da apoptose, bem como de um gene de resistência à apoptose (BIRC-5). Para isso, foi avaliado o efeito de majoranolídeo, em quatro concentrações, no comprometimento da integridade de membrana plasmática (MP) nas células HL-60, através do ensaio de viabilidade celular por 7-AAD. Para quantificar a caspase-3, ativada por dímero de desidrogoniotalamina, em células MDA-MB-231, utilizou-se o anticorpo PE Rabbit Anti-Active caspase-3. A expressão gênica foi analisada nas duas linhagens em estudo, tratadas com seus respectivos compostos, seguindo-se os passos de extração do RNA total, síntese do cDNA e posterior quantificação relativa por PCR em tempo real (RT-qPCR). Os dados de expressão gênica foram normalizados pelo gene constitutivo β-actina e calculados com o software CFX Manager 3.1 (Bio-Rad). Após 48 h de tratamento, o majoranolídeo, na concentração de 50 μM, causou permeabilização de MP em células HL-60, caracterizando inviabilidade/morte celular. Nesse mesmo período, o composto causou up-regulação de BAX e caspase-8 (pró-apoptóticos), além de down-regulação em BIRC-5 (antiapoptótico), sugerindo uma possível ativação das vias intrínseca e extrínseca da apoptose. Para células MDA-MB-231, após 48 horas de tratamento foi encontrada ativação significativa de caspase-3 com dímero de desidrogoniotalamina (63 μM), bem como up-regulação de BAX, sem efeitos significativos para os demais genes em estudo. Os resultados obtidos somam-se aos conhecimentos disponíveis sobre os efeitos citotóxicos dos compostos majoranolídeo e dímero de desidrogoniotalamina em células leucêmicas e de câncer de mama, respectivamente, e impulsionam estudos subsequentes dessas espécies e de outras plantas do Cerrado, na busca de compostos bioativos anticâncer. |
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| Atividade anti Trypanosoma cruzi de Pogonopus tubulosus e Ocotea lancifolia |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
15/02/2018 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
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| Banca |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
- Alessandra Gutierrez de Oliveira
- Fernanda Rodrigues Garcez
- Maria Carolina Silva Marques
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| Resumo |
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas nas Américas. É responsável por milhares de óbitos a cada ano e incapacita milhares de indivíduos ao trabalho, gerando assim, um grande ônus para o governo com o tratamento dos doentes. Os tratamentos atualmente utilizados são eficazes em 50% dos casos em fase aguda, porém são ineficazes no estágio crônico da doença. Nesse contexto, a utilização de bioensaios permite a detecção da atividade biológica de um extrato vegetal de maneira simples e aponta para estudos em busca de novos compostos com propriedades terapêuticas, além da elucidação de aspectos da biologia básica do parasita. O presente trabalho tem como objetivo a determinação da atividade anti T. cruzi de Pogonopus tubulosus e Ocotea lancifolia. Foram avaliadas a ação de diversos extratos, frações e alcaloides isolados de ambas as plantas frente às formas epimastigotas e amastigotas do parasita, por meio do ensaio do MTS, além da citotoxicidade frente as células Vero, por meio do ensaio do MTT. Além da atividade biológica, foram também elucidados alguns mecanismos de ação de alcaloides de P. tubulosus por meio de ensaios de curva de recuperação, influência no perfil proteico, exposição de Fosfatidilserina, degradação do DNA e ciclo celular. Os resultados indicam a potente ação de P. tubulosus frente as formas epimastigotas e amastigotas do parasita (com valores de IC50 inferiores à da droga controle Benznidazol) além de índices moderados de seletividade. O ensaio de curva de recuperação demonstrou a atividade tripanostática dos alcaloides isolados de P. tubulosus frente ao parasita, sendo corroborados pelos ensaios de exposição de fosfatidilserina e degradação do DNA (indicando ausência de eventos de morte celular), além de uma diminuição geral na síntese proteica. P. tubulosus representa uma promissora fonte de alcaloides com atividade biológica anti T. cruzi. A ausência de morte celular nos tratamentos com os isolados possibilita uma maior facilidade no estudo da biologia básica do parasita, que é de suma importância para o aumento das chances e possibilidades no tratamento da doença. |
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| Purificação e Caracterização Bioquímica das Amilases Produzidas por Aspergillus sp. e Neurospora crassa exo-1: imobilização da enzima em alginato de sódio |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
10/03/2017 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Giovana Cristina Giannesi
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
- Evelyn de Andrade Salomão
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| Banca |
- Carla Santos de Oliveira
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Giovana Cristina Giannesi
- Jeandre Augusto Otsubo Jaques
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| Resumo |
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| Produção, Caracterização bioquímica e Aplicação de Proteases produzidas por Fungos Filamentosos |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
09/09/2016 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
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| Banca |
- Douglas Chodi Masui
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Giovana Cristina Giannesi
- Newton Valério Verbisck
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| Resumo |
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| Purificação e Caracterização bioquímica da xilanase produzida por Aspergillus japonicus e Imobilização em alginato |
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| Curso |
Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Dissertação |
| Data |
31/08/2016 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Giovana Cristina Giannesi
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| Coorientador(es) |
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| Orientando(s) |
- Patrícia Oliveira da Silva
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| Banca |
- Denis Pires de Lima
- Douglas Chodi Masui
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Giovana Cristina Giannesi
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| Resumo |
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