Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular

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TRABALHO Ações
Avaliação da Atividade Anticâncer do Inibidor de Peptidase Inga laurina Trypsin Inhibitor (ILTI)
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 12/04/2022
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Maria Ligia Rodrigues Macedo
Coorientador(es)
    Orientando(s)
    • Queisielle Magalhães Carvalho de Souza
    Banca
    • Adilson Beatriz
    • Cicero Rafael Cena da Silva
    • Douglas Chodi Masui
    • Maria Ligia Rodrigues Macedo
    • Teofilo Fernando Mazon Cardoso
    Resumo Inibidores de peptidase da família Kunitz possuem diversos mecanismos de ação anticâncer. O Inga laurina Trypsin inhibitor (ILTI) possui atividade inseticida, fungicida e antibiofilme e foi recentemente produzido por expressão heteróloga com potencial atividade anticâncer in vitro. Entretanto, seu mecanismo de ação anticâncer não foi elucidado. A fim de incrementar os conhecimentos disponíveis sobre a ação anticâncer de inibidores de peptidase vegetais, propomos investigar as propriedades anticâncer do ILTI em modelo de leucemia. Para a obtenção das curvas de citotoxicidade do ILTI, realizou-se o teste de triagem com o sal tetrazólio MTT nas linhagens leucêmicas KG-1, Kasumi e K-562 expostas às concentrações de 0,5 e 5 μM de ILTI por 24 h. Seguiu-se com a avaliação da citotoxicidade com resazurina nas linhagens Raji, CCRF-CEM, KG-1, Kasumi-1 e K-562, expostas as concentrações de 0,1 e 0,5 μM de ILTI, por 24 h. O mecanismo de ação anticâncer do ILTI foi verificado no modelo de leucemia mielóide crônica K-562 por citometria de fluxo. Utilizou-se o ILTI a 0,07 μM, concentração correspondente ao IC50 obtido no ensaio de citotoxicidade com o iodeto de propidio (PI), em 24 h. O tipo de morte celular foi verificado utilizando-se dupla marcação com anexina-V-FITC/PI após 24 h de exposição ao ILTI. Realizou-se também o ensaio de ativação de caspase-3 com o anticorpo PE Rabbit Anti-Active Caspase-3 após 12 e 24 h. O ciclo celular foi analisado utilizando-se marcação com PI, após 24 h. O ILTI foi citotóxico para as linhagens Raji, CCRF-CEM, KG-1, Kasumi-1 e K-562. Células leucêmicas K-562 tratadas com o ILTI sofreram processo de apoptose mediado pela ativação de caspase-3. Aparentemente, apoptose foi a principal via de morte ativada, uma vez que houve um aumento insignificante de morte por necrose. É possível que a apoptose provocada por ILTI possua envolvimento com a parada do ciclo celular na fase G2/M observado em células K-562. Experimentos futuros incluem a ativação de caspase-9, liberação de citocromo C e perda de potencial mitocondrial, para trazer um melhor entendimento da atividade anticâncer do ILTI.
    Palavras-chave: leucemias, leucemia mielóide crônica, inibidores, apoptose.
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    Efeito da peçonha de escorpiões do gênero Tityus sobre a atividade das enzimas do sistema purinérgico em linfócitos e plaquetas de sangue periférico humano.
    Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
    Tipo Dissertação
    Data 31/03/2022
    Área BIOLOGIA GERAL
    Orientador(es)
    • Malson Neilson de Lucena
    Coorientador(es)
      Orientando(s)
      • TELMA RODRIGUES DA SILVA BENETTI
      Banca
      • Alda Maria Teixeira Ferreira
      • Andréia Machado Cardoso
      • Carla Santos de Oliveira
      • Malson Neilson de Lucena
      • Maria Rita Marques
      Resumo O sistema purinérgico é um sistema de sinalização, no qual os nucleotídeos de purina, ATP (Adenosina 5′-trifosfato) e ADP (Adenosina difosfato), e o nucleosídeo, adenosina, atuam como mensageiros extracelulares. CD39 (ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, E-NTPDase1) converte ATP em ADP e ADP em AMP, e então CD73 (ecto-5'-nucleotidase, Ecto5'NTase) desfosforila AMP em adenosina. CD39 e CD73 regulam a função de vários tipos de células imunológicas, incluindo linfócitos. Além disso, há evidências de que alterações na expressão e atividade de CD39 afetam o potencial trombogênico dos tecidos. O objetivo deste estudo foi quantificar a atividade enzimática da CD39 e CD73 na presença de peçonha de escorpiões Tityus confluens (Tc) e Tityus paraguayensis (Tp), em amostras de linfócitos e plaquetas humanos. Nossos resultados demonstram que a peçonha de T.c tem efeito supressor sobre atividade da CD39 na hidrólise de ATP em linfócitos do sangue periférico quando comparados ao controle (P<0,05). Por outro lado nossos resultados demonstram não haver efeito sobre as enzimas CD39 e CD73 em plaquetas do sangue periférico. Este estudo traz pela primeira vez o efeito da peçonha de escorpiões Tityus sobre as enzimas CD39 e CD73 em células do sangue periférico. Futuros estudos, com maiores doses, poderão elucidar a via de ação principal das peçonhas quando em contato com o sangue.
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      AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIMICROBIANO E ANTIBIOFILME DE UM INIBIDOR DE PEPTIDASE DE Inga cylindrica
      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
      Tipo Dissertação
      Data 31/03/2022
      Área BIOLOGIA GERAL
      Orientador(es)
      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
      Coorientador(es)
        Orientando(s)
        • Ana Paula Ramos Pereira
        Banca
        • Caio Fernando Ramalho de Oliveira
        • Carolina Turatti Oliveira
        • Fabiana Fonseca Zanoelo
        • Maria Ligia Rodrigues Macedo
        • Rita de Cassia Avellaneda Guimaraes
        Resumo A descoberta dos antibióticos revolucionou o controle das infecções. Entretanto, a história dos antibióticos e o desenvolvimento de resistência microbiana caminham lado a lado. Com isso, a busca por novos antimicrobianos se iniciou. Nas últimas décadas, os antimicrobianos oriundos de espécies vegetais vêm se destacando. Os inibidores de enzimáticos vegetais podem desestabilizar patógenos por meio de danos à membrana e/ou parede celular e alteração da permeabilidade celular. Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial antimicrobiano e antibiofilme do inibidor de tripsina de sementes de Inga cylindrica, investigar seu mecanismo de ação frente a leveduras patogênicas, bem como sua toxicidade em Galleria mellonella. Após o isolamento, a concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima (CFM) e a atividade antibiofilme foram avaliadas. Também foram analisados os efeitos sinérgicos do ICTI em associação a anfotericina B e a toxicidade do ICTI frente a G. mellonella. O ICTI é uma proteína constituída por uma única cadeia polipeptídica de aproximadamente 20 kDa. A atividade inibitória do ICTI foi específica para a tripsina. O ICTI não possui atividade bactericida, mas apresenta ação fungicida. ICTI apresentou CIM de 32,11 μM para C. albicans 90028 e C. gattii AFLP4. A combinação de ICTI com anfotericina B apresentou efeito sinérgico. A CIM do ICTI inibiu a formação do biofilme de C. albicans 90028 e C. gattii AFLP4, em 38,5% e 21,5%, respectivamente. A CIM de ICTI também promoveu a erradicação de formas maduras de biofilme de C. albicans 90028 e C. gattii AFLP4, 37,2% e 22,1, respectivamente. Com base nos resultados obtidos, sugerimos que a atividade antifúngica do ICTI envolva a ligação ao ergosterol presente na membrana celular fúngica. Essa ação específica também é observada nos antifúngicos poliênicos, como a anfotericina B. Dada a capacidade do ICTI se ligar ao ergosterol, danos na membrana ocorrem, promovendo o extravasamento do conteúdo intracelular, como demonstrado pelos resultados deste trabalho. Por fim, o ICTI não se mostrou tóxico quando administrado no modelo G. mellonella, o que suporta ensaios futuros em outros modelos animais.
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        Avaliação do potencial antimicrobiano dos extratos proteicos das sementes de Inga laurina (Fabaceae) e sua aplicação em uma preparação farmacêutica
        Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
        Tipo Dissertação
        Data 29/03/2022
        Área BIOLOGIA GERAL
        Orientador(es)
        • Maria Ligia Rodrigues Macedo
        Coorientador(es)
          Orientando(s)
          • Bruna Sanae Moroto
          Banca
          • Ana Cristina Jacobowski
          • Douglas Chodi Masui
          • Eduardo Benedetti Parisotto
          • Maria Ligia Rodrigues Macedo
          • Teofilo Fernando Mazon Cardoso
          Resumo A investigação de moléculas de origem vegetal com potencial atividade antimicrobiana tem ganhado cada vez mais relevância na prevenção e tratamento de diferentes enfermidades. O inibidor de tripsina de Inga laurina (ILTI), presente nas sementes dessa espécie, apresenta estabilidade sob ampla faixa de pH e temperatura. O objetivo desse estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana e antibiofilme do extrato obtido das sementes de I. laurina (EBS), investigar os potenciais mecanismos de ação associados e incorporar, pela primeira vez, o EBS em nanopartículas mesoporosas de sílica (SiO2NPs) para comparar a atividade antimicrobiana na ausência e presença do nanocarreador, bem como desenvolver e avaliar a atividade antimicrobiana de uma preparação tópica semissólida contendo o extrato. Frutos maduros de I. laurina foram coletados e as sementes foram separadas da polpa. Após desidratadas e trituradas, a farinha das sementes foi extraída com tampão fosfato de potássio 0,1 M + NaCl 0,15 M, pH 7,6, a 25°C, por 2 h, sob agitação magnética. Após a centrifugação, o sobrenadante foi denominado EBS. A atividade antimicrobiana foi determinada in vitro pelo método de microdiluição em caldo, por meio da determinação dos valores de concentração inibitória mínima (CIM). Para avaliar a toxicidade aguda do EBS, utilizou-se o modelo invertebrado de Galleria mellonella. Diferentes preparações semissólidas na concentração de 1% (p/p) de EBS foram produzidas e a atividade antimicrobiana foi testada in vitro pelo método de difusão em ágar frente a Candida albicans. O controle foi feito com o creme comercial Nistatina. Diferentes concentrações de EBS na preparação (1, 5, 10, 15 e 20%) foram testadas. Após a seleção da melhor concentração, realizou-se o estudo de estabilidade acelerado em temperatura controlada de 40°C ± 2°C durante intervalos selecionados até 30 dias, em que se analisou as características de homogeneidade, odor, cor, pH e atividade microbiológica. O EBS foi ativo na concentração de 4 mg/mL, apresentando especificidade contra fungos e não inibindo o crescimento bacteriano. A menor CIM foi reportada para C. gattii, (31,25 µg/mL) e contra diferentes espécies de Candida, a CIM variou entre 250 e 1000 µg/mL. No ensaio com G. mellonella, o EBS não demonstrou toxicidade nas doses testadas. Após a síntese das SiO2NPs, cerca de 50,34% do EBS foi incorporado às nanopartículas, por meio da análise termogravimétrica. No entanto, as nanopartículas incorporadas ao EBS não apresentaram atividade antimicrobiana. Dentre as preparações, a que apresentou melhor atividade foi o gel base de Carbopol-940 incorporado ao extrato. Houve um aumento significativo (p<0,05) na atividade antifúngica do gel na concentração de 5% (p/p) de EBS. Acima dessa concentração, não houve aumento significativo na atividade antifúngica. No estudo de estabilidade acelerado, a preparação do gel a 5% apresentou halo de inibição de 14,66 ± 1,22 mm no tempo zero, sendo maior que o halo do controle. Porém, ao longo do estudo, houve perda da atividade após 21 dias. As características de pH, odor e homogeneidade não se alteraram significativamente ao final de 30 dias. Este é o primeiro estudo que propõe o desenvolvimento de uma preparação semissólida contendo o extrato das sementes de I. laurina e, além de não tóxico, o extrato possui potencial aplicação tecnológica no tratamento de infecções tópicas associadas a Candida, instigando estudos futuros que avaliem a reformulação da base semissólida a fim de prolongar sua atividade na preparação.
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            DESENHO DE UM NOVO PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO ULTRACURTO GUIADO POR FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS
            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
            Tipo Dissertação
            Data 28/03/2022
            Área BIOLOGIA GERAL
            Orientador(es)
            • Maria Ligia Rodrigues Macedo
            Coorientador(es)
              Orientando(s)
              • MARIA CAROLINE DE MOURA CAVALHEIRO
              Banca
              • Caio Fernando Ramalho de Oliveira
              • Fabiana Fonseca Zanoelo
              • Malson Neilson de Lucena
              • Maria Ligia Rodrigues Macedo
              • Marlon Henrique e Silva Cardoso
              Resumo Os peptídeos antimicrobianos possuem sítios de ação diferente dos antibióticos convencionais. Pesquisas recentes têm buscado por peptídeos capazes de controlar bactérias multirresistentes, sem apresentar efeitos colaterais contra células saudáveis. Neste trabalho descrevemos as propriedades antimicrobianas do RK8, um peptídeo ultracurto, que possui 8 resíduos de aminoácidos. As características físico-químicas do RK8 foram projetadas previamente através de ferramentas computacionais. A estrutura secundária de RK8 foi determinada na presença de água e condições que mimetizam as membranas biológicas por dicroísmo circular (CD). O peptídeo foi testado contra cepas de bactérias multirresistentes Gram-negativas e Gram-positivas. O efeito sinérgico de RK8 e ciprofloxacino foi avaliado contra Escherichia coli KPC+ e Acinetobacter baumannii multirresistente. A capacidade de erradicar biofilmes maduros multirresistentes de A. baumannii também foi avaliada. Ensaios de citotoxicidade in vitro e in vivo foram realizados. A estabilidade do RK8 contra peptidases foi investigada ‘em solução de soro fetal bovino a 25% e seu mecanismo de ação sobre a membrana microbiana avaliada através da a captação do intercalante de DNA Sytox green. Análises de CD mostraram que o RK8 assumiu uma estrutura não-ordenada em água e dodecil sulfato de sódio (SDS), sugerindo que mesmo sendo originalmente desenhado para assumir uma estrutura secundária do tipo alfa-hélice, devido ao seu tamanho reduzido, o peptídeo atua sobre membranas com uma estrutura estendida. O peptídeo apresentou uma concentração inibitória mínima (CIM) contra MRSA ATCC33591 e ATCC43300 de 8 e 16 µM, respectivamente. Para E. coli KPC+ e A. baumannii, RK8 apresentou uma CIM de 16 e 64 µM, respectivamente. A combinação de RK8 e o ciprofloxacino apresentou efeito sinérgico contra E. coli KPC+, reduzindo em 32 vezes e 8 vezes a concentração do antibiótico e do peptídeo, respectivamente, para exercer efeitos antimicrobianos. O RK8 foi capaz de erradicar 38% do biofilme maduro de A. baumannii, quando utilizado na CIM ou na metade dela, afetando a estrutura do biofilme e a viabilidade bacteriana. O RK8 não apresentou efeitos citotóxicos contra macrófagos murinos (até 64 µM) ou contra eritrócitos (até 100 µM) ou contra larvas de Galleria mellanella (até 960 µM). No ensaio de estabilidade contra peptidases, o RK8 se mostrou estável, mantendo cerca de 60% da molécula íntegra após 120 min de incubação. Neste mesmo tempo de ensaio, o reagente Sytox Green alcançou 100% de permeação de membrana de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em resumo, RK8 representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de um novo agente antimicrobiano e antibiofilme contra bactérias multirresistentes.
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                Estudo de reposicionamento de fármacos com potencial atividade contra enzimas do metabolismo de Trypanosoma cruzi
                Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                Tipo Dissertação
                Data 25/03/2022
                Área BIOLOGIA GERAL
                Orientador(es)
                • Alda Maria Teixeira Ferreira
                Coorientador(es)
                  Orientando(s)
                  • Caroline Silva Garcia
                  Banca
                  • Alda Maria Teixeira Ferreira
                  • Carla Cardozo Pinto de Arruda
                  • Carla Leticia Gediel Rivero Wendt
                  • Malson Neilson de Lucena
                  • Renata Trentin Perdomo
                  Resumo Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas, uma das principais doenças de saúde pública de interesse na América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento dessa doença (benznidazol e nifurtimox) apresentam maior eficácia na fase aguda, porém são relatados inúmeros casos de efeitos adversos. Nesse panorama, o reposicionamento de fármacos tem se tornado uma estratégia importante por ser uma alternativa mais rápida e menos onerosa do que a descoberta e o desenvolvimento de novos fármacos. Este trabalho teve como objetivo a seleção in silico de fármacos já aprovados para uso clínico em humanos com potencial atividade contra T. cruzi cepa Dm28.Foram utilizadas bases de dados on-line e gratuitas para a busca e seleção de drogas com potencial ação sobre enzimas homólogas dos metabolismos energético e lipídico do T. cruzi, com base na identificação de alvos de drogas com alta similaridade aos genes de patógenos. Na base de dados TDR Targets foram identificados 139 e 151 genes codificadores de enzimas do metabolismo energético e do metabolismo lipídico de T. cruzi, respectivamente. Posteriormente, obteve-se a sequência aminoacídica das enzimas citadas na base de dados TriTrypDB. As sequências foram inseridas nos bancos de dados DrugBank e no Therapeutic Targets para identificação de alvos de drogas homólogos. Dentre as sequências proteicas com resultados positivos, foram incluídas somente aquelas com E-value<1e-10. As sequências incluídas apresentaram correspondência com 265 fármacos para o metabolismo energético e 387 para o lipídico. Dessas, 56 e 42, respectivamente, eram drogas já aprovadas para o uso em humanos. Em seguida, foi realizada a seleção dos fármacos cuja atividade anti-T. cruzi Dm28c não havia sido previamente reportada, utilizando os bancos de dados PUBMED, LILACS e Google Acadêmico, resultando em 19 fármacos para o metabolismo energético e 25 para o lipídico. Dos 44 fármacos identificados no estudo como potenciais agentes anti-T. cruzi, 7 foram submetidos a testes in vitro. Dentre os fármacos testados, o nitrato de oxiconazol e o lansoprazol se mostraram ativos contra formas epimastigotas de T. cruzi, entretanto, apenas o segundo teve atividade contra formas tripomastigotas do parasito. Além disso, a estratégia in silico de reposicionamento de fármacos utilizada neste trabalho elencou mais 37 fármacos, ainda não submetidos a testes in vitro, com potencial ação anti-T. cruzi.

                  Palavras-chave: Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, Reposicionamento de Fármacos, In Silico
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                    Caracterização bioquímica e biológica da peçonha e hemolinfa de Tityus paraguayensis
                    Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                    Tipo Dissertação
                    Data 03/03/2022
                    Área BIOLOGIA GERAL
                    Orientador(es)
                    • Malson Neilson de Lucena
                    Coorientador(es)
                      Orientando(s)
                      • Henrique Ranieri Covali Pontes
                      Banca
                      • Fabiana Fonseca Zanoelo
                      • Ludovico Migliolo
                      • Malson Neilson de Lucena
                      • Monica Cristina Toffoli Kadri
                      • Renata dos Santos Rodrigues
                      Resumo Os escorpiões são artrópodes pertencentes a ordem Scorpiones, com aproximadamente 2654 espécies descritas e distribuídas por diversos ecossistemas, sendo muitas destas endêmicas. Estes animais apresentam hemolinfa e glândulas de peçonha, contendo a peçonha que pode ser inoculada na presa pelo télson. Portanto, os escorpiões são animais peçonhentos, embora cerca de 50 espécies apresentem importância médica. Tanto a hemolinfa, quanto a peçonha apresentam componentes com diversas funções bioquímicas e biológicas, entre essas algumas de interesse farmacológico e/ou biotecnológico. Visto isso, o presente estudo teve como objetivo caracterizar bioquímica e biologicamente a peçonha e hemolinfa do escorpião endêmico de Mato Grosso do Sul, T. paraguayensis. Para este fim, foram realizadas as seguintes etapas: ensaios eletroforéticos; atividades proteolíticas, fosfolipásicas A2, lipolíticas e antitríptica; atividade antitripanossômica; avaliação da citotoxicidade; efeito da peçonha e hemolinfa sobre a atividade (Na+,K+)-ATPase; e obtenção de perfil cromatográfico. Observou-se nos ensaios eletroforéticos e cromatográficos que a peçonha apresenta uma grande diversidade de componentes, também se detectou atividade proteolítica, fosfolipásica e lipolítica, ademais a peçonha provocou um aumento de atividade da enzima (Na+,K+)-ATPase e uma diminuição da viabilidade de formas epimastigota de T. cruzi. Não foram observadas citotoxicidade contra células normais e atividade antitríptica da peçonha de T. paraguayensis. A hemolinfa por sua vez, apresentou baixa diversidade de proteínas, além da presença de atividades proteolítica e lipolítica. Os resultados demonstram que a peçonha e hemolinfa de T. paraguayensis apresentam potencial para bioprospecção de compostos de interesse farmacológico e/ou biotecnológicos, necessitando de novos estudos para caracterizar e isolar estes componentes.
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                      ATIVIDADES BACTERICIDAS E ANTICANCERÍGENAS DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DE SEMENTES DE Enterolobium timbouva
                      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                      Tipo Dissertação
                      Data 20/12/2021
                      Área BIOLOGIA GERAL
                      Orientador(es)
                      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                      Coorientador(es)
                        Orientando(s)
                        • PAULA BÊLIT MAZACOTE ZENTENO
                        Banca
                        • Eduardo Benedetti Parisotto
                        • Fabiana Fonseca Zanoelo
                        • Josy Goldoni Lazarini
                        • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                        • Rita de Cassia Avellaneda Guimaraes
                        Resumo Um dos problemas enfrentados mundialmente é a resistência microbiana. Nesse contexto, inibidores de peptidases vegetais que têm potencial atividade antimicrobianos e também podem servir como modelo para o desenho de novos fármacos, capazes de induzir morte. Nesse trabalho objetivou-se isolar e purificar um inibidor de tripsina das sementes de Enterolobium timbouva (EtTI), além de verificar suas atividades bactericidas e antitumorais. O EtTI foi purificado em duas etapas cromatográficas. A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com dodecil- sulfato de sódio (SDS) revelou que EtTI possui um peso molecular aproximado de 19 kDa. O EtTI apresentou concentração inibitória mínima (CIM) para espécies de bactérias Gram-positivas: Staphylococcus epidermidis (9µM), Staphylococcus haemolyticus (9µM) e Staphylococcus saprophyticus (4.5µM) e Gram-negativa: Escherichia coli (9µM). Ao fazer o tratamento com CIM e 10 vezes o valor de CIM obtivemos os resultados para biofilmes: redução na formação do biofilme e no biofilme maduro para a cepa S. saprophyticus. Imagens representativas de ensaio com biofilme, foram obtidas por microscopia de fluorescência. No ensaio com Sytox Green - permeável em células com membranas danificadas – tivemos uma permeação 48% em 2 horas, indicando possível mecanismo por dano de membrana. Além disso, EtTI mostrou efeito sinérgico com o antibiótico Vancomicina. Na avaliação de atividade anticâncer, o inibidor apresentou um IC50 de 2,69µM em células de melanoma murino. Em teste in vivo, através de modelo invertebrado Galleria mellonela, EtTI não apresentou toxicidade aguda nas concentrações estudadas. A atividade biológica de EtTI demostra potencial antimicrobiano e, a partir da elucidação da sequência do EtTI, peptídeos antimicrobianos podem ser desenhados a fim de se obter potenciais moléculas com aplicação clínica.
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                          PERFIL DE CITOCINAS EM PACIENTES COM CERVICITE, LESÕES CERVICAIS OU CARCINOMA CERVICAL
                          Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                          Tipo Dissertação
                          Data 09/12/2021
                          Área BIOLOGIA GERAL
                          Orientador(es)
                          • Ines Aparecida Tozetti
                          Coorientador(es)
                            Orientando(s)
                            • Mariana Mayumi Tadokoro
                            Banca
                            • Alda Maria Teixeira Ferreira
                            • GISELE FACHOLI BOMFIM
                            • Ines Aparecida Tozetti
                            • Luana Silva Soares
                            • Marco Antonio Moreira Puga
                            Resumo O Papilomavírus humano (HPV) é um agente infeccioso que tem a capacidade
                            de induzir infecções crônicas sem repercussão sistêmica, e isso ocorre por vários
                            motivos, como: ser exclusivamente intraepitelial, não promover inflamação ou lise
                            celular, causar pouca ou nenhuma viremia, de certa forma, não ativando precocemente
                            os mecanismos de alerta do sistema imune inato. É sabido que devido aos mecanismos
                            pelos quais as células infectadas pelo HPV escapam da vigilância imunológica,
                            incluindo a diminuição e ou alteração do perfil de citocinas, a persistência da infecção
                            viral poderá ocorrer e assim culminar em alterações celulares tais como Lesão
                            intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) e Carcinoma cervical (CC). O estudo sobre
                            perfis de citocinas é de extrema relevância para melhor entendimento sobre a infecção
                            por HPV e a resposta imune do hospedeiro fornecendo assim uma compreensão mais
                            elucidativa sobre citocinas como biomarcadores, possibilitando a busca por novos
                            fármacos, estratégias de diagnósticos e tratamentos. O objetivo deste estudo foi
                            detectar o perfil de citocinas em pacientes com cervicite, lesões cervicais ou
                            carcinoma cervical. Foi realizada para tanto, uma pesquisa descritiva, observacional de
                            corte transversal envolvendo pacientes atendidas no Hospital de Amor, unidade de
                            Campo Grande – MS no durante o ano de 2019 e 2020, onde selecionou-se pacientes
                            submetidas à citologia cervical, biopsia do colo uterino e pesquisa de HPV de alto
                            risco oncogênico (HR-HPV) pelo método Cobas® HPV Test. Foram incluídas no
                            estudo 66 pacientes do com idade entre 25 a 65 anos (média de 42,29 anos). A análise
                            de citocinas em pacientes com cervicite, lesões cervicais ou carcinoma cervical
                            demonstrou que a IL-6 está em maior concentração em pacientes positivas para
                            HPV16 que em relação a pacientes que positivaram para outros tipos de HR-HPV
                            (p<0,05). A IL-17 esteve presente em maior concentração em pacientes com cervicite,
                            HSIL e carcinoma, também em pacientes HPV negativos, embora estes resultados não
                            tenham sido significativos.
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                            Produção, purificação, caracterização e avaliação do potencial biotecnológico da endo-xilanase do fungo termofílo Humicola brevis var. thermoidea
                            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                            Tipo Dissertação
                            Data 10/06/2021
                            Área BIOLOGIA GERAL
                            Orientador(es)
                            • Douglas Chodi Masui
                            Coorientador(es)
                              Orientando(s)
                              • ALINE PEREIRA DE ALMEIDA
                              Banca
                              • Douglas Chodi Masui
                              • Fabiana Fonseca Zanoelo
                              • MARIA DE LOURDES TEIXEIRA DE MORAES POLIZELI
                              • Roberto Ruller
                              Resumo A biodegradação da biomassa lignocelulósica, particularmente da hemicelulose, depende de um grupo de enzimas denominado de complexo hemicelulolítico, produzidas principalmente por fungos e bactérias. Dentre estas hemicelulases, as endo-xilanases têm sido amplamente utilizadas com objetivo de se valorizar a hemicelulose na aplicação em bioprocessos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi produzir, purificar, caracterizar e avaliar o potencial biotecnológico da endo-xilanase de Humicola brevis var. thermoidea na sacarificação da biomassa lignocelulósica. Com este intuito, a partir do coquetel enzimático obtido através de fermentação em estado sólido, a endo-xilanase nativa (XylHb) foi purificada. A caracterização biofísica das estruturas secundárias por dicroísmo circular indicaram a predominância de folhas β, uma característica típica de endo-xilanases da família GH11 e a análise da fluorescência intrínseca dos Trp indicaram que a proteína tem o seu enovelamento terciário com os resíduos de Trp imersos em um ambiente hidrofóbico. Os resultados das caracterizações bioquímicas e cinéticas da XylHb indicaram que a enzima apresentou uma maior tolerância em uma ampla faixa de pH, temperatura, NaCl e etanol, tendo um melhor desempenho em hidrolisar a xilana birchwood em temperaturas de 50 e 60 ºC quando compara a xilanase comercial (Cellic®HTec2). Os ensaios de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado hidrotérmicamente demonstraram que a suplementação de Cellic®CTec2 com XylHb apresentaram interações sinérgicas e elevaram significativamente a liberação de glicose e açúcares redutores totais quando comparados ao padrão comercial Cellic®Ctec2 individual. Assim, a XylHb purificada do extrato enzimático de H. brevis var. thermoidea por apresentar propriedades físico-químicas potenciais, performances e sinergismo com celulase comercial, que são características importantes para a aplicação em ambiente industrial, poderá contribuir como uma alternativa biotecnológica promissora para aplicação e valorização da hemicelulose na produção de bioprodutos.
                              Purificação, caracterização bioquímica e imobilização de uma β-glucosidase de Rasamsonia composticola
                              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                              Tipo Dissertação
                              Data 28/05/2021
                              Área BIOLOGIA GERAL
                              Orientador(es)
                              • Fabiana Fonseca Zanoelo
                              Coorientador(es)
                                Orientando(s)
                                • Isabela Pavão Vargas
                                Banca
                                • Douglas Chodi Masui
                                • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                • Giovana Cristina Giannesi
                                • Roberto Ruller
                                • Rodrigo Simões Rodrigues
                                Resumo As β-glucosidases são enzimas que fazem parte do complexo celulolítico com a capacidade de atuar sobre materiais lignocelulósicos promovendo sua hidrólise. Essas enzimas são produzidas por microrganismos, principalmente os fungos filamentosos. Possuem variadas aplicações como na indústria de papel e celulose, alimentícia, ração animal e na produção de etanol de segunda geração. O presente trabalho descreve a purificação, características bioquímicas e imobilização de uma β-glucosidase produzida pelo fungo termofílico Rasamsonia composticola. A enzima foi purificada utilizando duas etapas cromatográficas, incluindo a troca iônica DEAE-Fractogel e hidrofóbica Phenyl-Sepharose. Foi purificada 19 vezes com rendimento final de 14%. A β-glucosidase purificada apresentou temperatura ótima de 70°C, permanecendo estável em temperaturas de 65 a 70°C durante até 8 horas, pH 5,0, e uma massa molecular de aproximadamente 45 kDa. A enzima não foi estimulada pela maioria dos compostos químicos testados, entretanto foi levemente estimulada pelos detergentes saponina e triton X-100, além dos quelantes EDTA e EGTA e o agente redutor Temed. A enzima apresentou atividade sobre os substratos sintéticos pNP-Glc e pNP-Xyl, e demonstrou ser tolerante a glicose e estimulada por xilose (1-100 mM). Os parâmetros cinéticos estimados para a β-glucosidase foram de Km e Vmax de 2,3 mM e 0,0221 µmol/min/mg para pNP-Glc. A eficiência catalítica (Kcat/Km) da enzima foi de 7,7x10-11. Para pNP-Glc + glicose e pNP-Glc + xilose a enzima apresentou Km e Vmax de 2,33 mM e 0,0271 µmol/min/mg e 2,02 mM e 0,0255 µmol/min/mg, respectivamente. A enzima foi imobilizada em glioxil agarose cerca de 40% e 56% na presença de glicose durante 60 minutos. Demonstrou atividade ótima em pH 5,0 e 75°C. A enzima imobilizada apresentou estabilidade nas temperaturas de 75 a 80°C durante 60 minutos de reação. Os resultados demonstram que o fungo Rasamsonia composticola pode ser um candidato a contribuir para o conhecimento das propriedades de uma β-glucosidase com grande potencial de aplicação biotecnológica.
                                Efeito de Diaril Dissulfetos sobre Trypanosoma cruzi
                                Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                Tipo Dissertação
                                Data 10/03/2021
                                Área BIOLOGIA GERAL
                                Orientador(es)
                                • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                Coorientador(es)
                                  Orientando(s)
                                  • Bruna Migliorini Melo Silva
                                  Banca
                                  • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                  • Alessandra Gutierrez de Oliveira
                                  • Edson dos Anjos dos Santos
                                  • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                  • Malson Neilson de Lucena
                                  Resumo Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, considerado o agente etiológico da
                                  doença de Chagas. No Brasil, estima-se que mais de três milhões de pessoas sofrem com esta
                                  moléstia e que apesar dos investimentos em saneamento básico e ações preventivas para o seu
                                  controle, este ainda é um problema sério de saúde, afetando as pessoas mais pobres, que
                                  vivem em áreas rurais e com baixas condições de moradia. Os medicamentos atualmente
                                  utilizados são pouco eficazes na fase crônica da doença e apresentam uma série de efeitos
                                  colaterais. Algumas classes de compostos orgânicos representam alternativas potenciais para
                                  o desenvolvimento de novos fármacos. É o caso da classe dos dissulfetos de diarila, cujos
                                  compostos apresentam propriedades interessantes que vêm sendo exploradas em diversas
                                  áreas da química sintética, farmacêutica e também na produção de polímeros. Sendo assim,
                                  este trabalho teve como objetivo a avaliação de cinco compostos sintéticos dessa classe
                                  quanto à atividade sobre formas epimastigotas de T. cruzi. A metodologia utilizada envolveu
                                  ensaios biológicos para avaliação da viabilidade metabólica e do crescimento dos parasitas,
                                  além de ensaio de citotoxicidade em células Vero. Com base nos resultados foi observado que
                                  todos os compostos possuem atividade biológica sobre formas epimastigotas de T.cruzi. Os
                                  compostos A e D foram os mais ativos no tratamento in vitro durante 72h, apresentando
                                  valores de CI50 de 3,5µM e 3,7µM, respectivamente. No entanto, após o tratamento dos
                                  parasitos por 24h, os compostos mais ativos foram o D e E, com valores de CL50 de 0,7µM e
                                  0,9µM, respectivamente. Quanto à avaliação de citotoxicidade sobre células Vero, os
                                  compostos A, C e E apresentaram os maiores valores de CC50 (34,1µM; 32,0µM e 30,5µM,
                                  respectivamente), enquanto o composto D mostrou ser o mais citotóxico dentre os cinco
                                  testados. Na curva de recuperação, todos os compostos foram capazes de inibir o crescimento
                                  dos parasitas em até 96h após a retirada da droga. Observou-se também que o alvo de ação no
                                  parasito depende, provavelmente, da posição do ligante em relação à ligação dissulfeto na
                                  estrutura dos compostos. Tais resultados indicam a ação dos compostos dissulfetos de diarila
                                  sobre mecanismos que influenciam na proliferação celular de T.cruzi, revelando dados
                                  promissores para futuras pesquisas.
                                  EFEITO DE DISSULFETOS DE DIARILA SOBRE Trypanosoma cruzi
                                  Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                  Tipo Dissertação
                                  Data 10/03/2021
                                  Área BIOLOGIA GERAL
                                  Orientador(es)
                                    Coorientador(es)
                                    Orientando(s)
                                      Banca
                                        Resumo Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, considerado o agente etiológico da
                                        doença de Chagas. No Brasil, estima-se que mais de três milhões de pessoas sofrem com esta
                                        moléstia e que apesar dos investimentos em saneamento básico e ações preventivas para o seu
                                        controle, este ainda é um problema sério de saúde, afetando as pessoas mais pobres, que
                                        vivem em áreas rurais e com baixas condições de moradia. Os medicamentos atualmente
                                        utilizados são pouco eficazes na fase crônica da doença e apresentam uma série de efeitos
                                        colaterais. Algumas classes de compostos orgânicos representam alternativas potenciais para
                                        o desenvolvimento de novos fármacos. É o caso da classe dos dissulfetos de diarila, cujos
                                        compostos apresentam propriedades interessantes que vêm sendo exploradas em diversas
                                        áreas da química sintética, farmacêutica e também na produção de polímeros. Sendo assim,
                                        este trabalho teve como objetivo a avaliação de cinco compostos sintéticos dessa classe
                                        quanto à atividade sobre formas epimastigotas de T. cruzi. A metodologia utilizada envolveu
                                        ensaios biológicos para avaliação da viabilidade metabólica e do crescimento dos parasitas,
                                        além de ensaio de citotoxicidade em células Vero. Com base nos resultados foi observado que
                                        todos os compostos possuem atividade biológica sobre formas epimastigotas de T.cruzi. Os
                                        compostos A e D foram os mais ativos no tratamento in vitro durante 72h, apresentando
                                        valores de CI50 de 3,5µM e 3,7µM, respectivamente. No entanto, após o tratamento dos
                                        parasitos por 24h, os compostos mais ativos foram o D e E, com valores de CL50 de 0,7µM e
                                        0,9µM, respectivamente. Quanto à avaliação de citotoxicidade sobre células Vero, os
                                        compostos A, C e E apresentaram os maiores valores de CC50 (34,1µM; 32,0µM e 30,5µM,
                                        respectivamente), enquanto o composto D mostrou ser o mais citotóxico dentre os cinco
                                        testados. Na curva de recuperação, todos os compostos foram capazes de inibir o crescimento
                                        dos parasitas em até 96h após a retirada da droga. Observou-se também que o alvo de ação no
                                        parasito depende, provavelmente, da posição do ligante em relação à ligação dissulfeto na
                                        estrutura dos compostos. Tais resultados indicam a ação dos compostos dissulfetos de diarila
                                        sobre mecanismos que influenciam na proliferação celular de T.cruzi, revelando dados
                                        promissores para futuras pesquisas
                                        EXPRESSÃO DE p16 E CITOCINAS IL-6 E TNF-α EM LESÕES CERVICAIS DE PACIENTES POSITIVAS PARA DNA DE PAPILOMAVÍRUS HUMANO DE ALTO RISCO ONCOGÉNICO
                                        Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                        Tipo Dissertação
                                        Data 14/05/2020
                                        Área BIOLOGIA GERAL
                                        Orientador(es)
                                        • Ines Aparecida Tozetti
                                        Coorientador(es)
                                          Orientando(s)
                                          • Andrielli Rodrigues dos Santos
                                          Banca
                                          • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                          • Cacilda Tezelli Junqueira Padovani
                                          • Camila Mareti Bonin Jacob
                                          • Ines Aparecida Tozetti
                                          Resumo A infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) representa o principal fator de risco para o
                                          desenvolvimento do câncer cervical e da p16 no ciclo celular, pode ser utilizada como indicador
                                          da participação do HPV na carcinogênese de células epiteliais. Sabe-se que tanto a imunidade
                                          natural, quanto a adaptativa exercem papel importante na eliminação de tumores, sendo que
                                          alguns componentes da resposta imune, tais como: a interleucina-6 (IL-6), o TNF-α (fator de
                                          necrose tumoral) capazes de modular o processo inflamatório crônico induzindo a proliferação,
                                          invasão e metástase de células tumorais. A partir disso, este estudo tem como objetivo detectar
                                          a expressão de p16 e das citocinas IL-6 e TNF-α em lesões cervicais de pacientes positivas para
                                          DNA de HPV de alto risco oncogênico. Foram analisados cortes histológicos de cérvice uterina
                                          provenientes de 12 pacientes submetidas previamente à detecção de DNA de HPV, pelo método
                                          cobas® HPV Test, com resultados histopatológicos de Lesão intraepitelial escamosa de alto
                                          grau (HSIL). A imunohistoquímica de marcação simples foi realizada utilizando recuperação
                                          antigênica por calor úmido, sistema HiDef Detection HRP Polymer System (Cell Marque,
                                          California, USA) e os anticorpos primários anti-IL-6 (Abcam©, ab9324), anti-TNF-α
                                          (Abcam©, ab8348) e anti-P16 (Abcam©, ab51243). As células imunomarcadas presentes no
                                          estroma da cérvice uterina e no epitélio foram detectadas e quantificadas através dos softwares
                                          Motic Images Plus 2.0 e Image J. 1.47 (National Institutes of Health, EUA), acoplados ao
                                          microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon, NY, USA) e câmera digital Moticam 2300 3.0
                                          Megapixels. Observou-se maior número de células imunomarcadas para IL-6 (16790
                                          células/mm2) quando a expressão de p16 foi difusa fraco, talvez representando um possível
                                          papel na regressão das lesões, enquanto a imunomarcação de TNF-α foi presente em maior
                                          número de células (9270 células/mm2) quando a expressão de p16 apresentou-se com o padrão
                                          difuso/forte nas amostras positivas para DNA de HPV de alto risco oncogênico. A expressão
                                          da p16, quando observada no epitélio, apresentou padrão difuso/forte.
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                                            Produção e Caracterização Bioquímica de Xilanase Produzida pelo Fungo Termofílico Rasamsonia composticola utilizando resíduos agroindustriais
                                            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                            Tipo Dissertação
                                            Data 13/03/2020
                                            Área BIOLOGIA GERAL
                                            Orientador(es)
                                            • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                            Coorientador(es)
                                              Orientando(s)
                                              • Daniel Guerra Franco
                                              Banca
                                              • Douglas Chodi Masui
                                              • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                              • Malson Neilson de Lucena
                                              • Newton Valério Verbisck
                                              Resumo Os fungos filamentosos são micro-organismos capazes de produzir inúmeras enzimas de
                                              interesse biotecnológico. Dentre essas enzimas, as xilanases, merecem destaque uma vez
                                              que são responsáveis pela degradação da xilana, o segundo polissacarídeo mais abundante
                                              na natureza. Essas enzimas apresentam potencial de aplicação nas indústrias têxtil, de
                                              alimentos, de detergentes e na produção de bioetanol de segunda geração. Nesse estudo
                                              foi realizado a otimização da produção de xilanase utilizando resíduos agroindustriais em
                                              fermentação em estado sólido para um fungo mesofílico, o Aspergillus flavus e outro
                                              termofílico, o Rasamsonia composticola e posteriormente a enzima foi purificada e
                                              caracterizada Após determinar R. composticola como o melhor produtor de xilanase, a
                                              enzima foi purificada utilizando-se dois métodos cromatográficos: resina hidrofóbica
                                              (Phenyl-Sepharose), seguida de exclusão por peso molecular (Sephacryl-S200). Foram
                                              obtidos um fator de purificação de 30,6 vezes e rendimento de 22%. A análise em gel de
                                              poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE 12%), não-desnaturantes
                                              (PAGE) e zimograma demonstraram uma única banda e um peso molecular estimado de
                                              53 kDa. A enzima apresentou um pH e temperatura ótimos de 5.5 e 80°C,
                                              respectivamente, e quando incubada a 70°C por 30 minutos a enzima mantém 100% de
                                              atividade. A enzima foi estimulada em 20% utilizando 1mM MgSO4, inibida por 5 mM
                                              de CuSO4, e estável na presença dos detergentes saponina e Triton X-100. Os solventes
                                              orgânicos acetona e etanol ativaram a atividade enzimática em 85 e 75%,
                                              respectivamente. A xilanase hidrolisou os substratos: xilana oat spelt, xilana birchwood,
                                              CMC e Avicel, tendo apresentado um Km de 2,3±0,59 e 6,7±0,7 mg/mL, e Vmax de 173,7
                                              ±6,5 e 446,7±12,7 μmol/min/mg para Xilana birchwood e Xilana oat spelt,
                                              respectivamente. Não houve inibição por compostos fenólicos mesmo após 8 horas de
                                              incubação. No teste de armazenamento, a enzima foi estável após 7 dias em temperatura
                                              ambiente (22°). Os resultados demonstraram que a xilanase de R. composticola possui
                                              características bioquímicas com grande potencial para aplicações biotecnológicas.
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                                                Purificação e caracterização de uma poligalacturonase produzida por Aspergillus japonicus e sua aplicação na clarificação de sucos de frutas
                                                Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                Tipo Dissertação
                                                Data 13/03/2020
                                                Área BIOLOGIA GERAL
                                                Orientador(es)
                                                • Giovana Cristina Giannesi
                                                Coorientador(es)
                                                  Orientando(s)
                                                  • Larissa Costa Olarte
                                                  Banca
                                                  • Douglas Chodi Masui
                                                  • Giovana Cristina Giannesi
                                                  • Jeandre Augusto Otsubo Jaques
                                                  • Malson Neilson de Lucena
                                                  Resumo Pectinases (EC 3.2.1.15) são enzimas que catalisam a hidrólise da pectina, um dos
                                                  principais polissacarídeos da parede primária de plantas superiores. Fungos
                                                  filamentosos, principalmente do gênero Aspergillus, são eficientes produtores de
                                                  enzimas pectinolíticas. Dentre as pectinases, poligalacturonases têm sido
                                                  extensivamente estudadas devido às suas potenciais aplicações, como por exemplo o,
                                                  nas industrias de alimentos, promovendo a clarificação de suco de frutas. Apesar das
                                                  diversas aplicações industriais, o alto custo e a instabilidade, faz com que o uso
                                                  comercial das enzimas permaneça limitado. A produção rápida e purificação de enzimas
                                                  em poucas etapas é uma opção na superação desses obstáculos. O objetivo desse
                                                  trabalho foi purificar e caracterizar uma exo-PGase produzida por Aspergillus japonicus
                                                  e a clarificação de suco de frutas. Entre os 7 fungos testados, A. japonicus mostrou a
                                                  melhor produção de PGase (0,389 U/mL) em meio líquido e purificação de 9,5 vezes
                                                  com 103% de rendimento. A enzima apresentou um peso molecular de
                                                  aproximadamente de 34 kDa (SDS-PAGE). O pH e a temperatura ótima para atividade
                                                  da enzima foi 5,0 e 55 °C, respectivamente. A 50°C a enzima apresentou meia vida após
                                                  10 min. Em pH 6,0 manteve-se estável durante 2h. Os íons CuSO4, FeCl3 e HgCl3
                                                  inibiram totalmente a atividade na concentração de 5mM. Em relação ao substrato, a
                                                  PGase mostrou maior especificidade (8,81 U/mL) para pectina de maçã. A enzima foi
                                                  classificada como exo-poligalacturonase por cromatografia em camada delgada de
                                                  sílica. O suco tratado com a enzima purificada (2 U/mL) proporcionou um aumento de
                                                  95,7%, 85,7% e 35,5% na clarificação da manga tommy, manga keitt e laranja,
                                                  respectivamente. A PGase de A. japonicus mostra potencial para ser aplicada na
                                                  clarificação de suco de frutas.
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                                                    Purificação e caracterização bioquímica de uma beta-glucosidase do fungo termófilo Humicola brevis var. thermoidea.
                                                    Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                    Tipo Dissertação
                                                    Data 12/03/2020
                                                    Área BIOLOGIA GERAL
                                                    Orientador(es)
                                                    • Douglas Chodi Masui
                                                    Coorientador(es)
                                                      Orientando(s)
                                                      • Luciane Gomes Freire
                                                      Banca
                                                      • Douglas Chodi Masui
                                                      • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                      • Giovana Cristina Giannesi
                                                      • Roberto Ruller
                                                      Resumo A biodegradação da biomassa lignocelulósica, particularmente da celulose, depende de
                                                      enzimas produzidas principalmente por microorganismos. Entre outras enzimas, as celulases e
                                                      -glucosidases atuam de forma a liberar unidades de celo-oligossacarídeos e glicose. Porém, a
                                                      maioria dessas celulases sofre uma inibição pela ação do seu próprio produto, além de serem
                                                      fortemente inibidas por glicose. O fungo termófilo Humicola brevis var. thermoidea mostrou
                                                      ser um bom produtor de uma β-glucosidase tolerante à glicose e estimulada por xilose, em
                                                      meio de cultivo sólido, simples e barato, constituído por somente farelo de trigo e água. A
                                                      clivagem da ligação glicosídica dos celo-oligossacarídeos e celobiose por β-glucosidase
                                                      estimuladas ou tolerantes à presença de glicose é de grande interesse industrial, pois é uma
                                                      enzima chave no processo de sacarificação de resíduos lignocelulósicos. Avanços em
                                                      processos biotecnológicos estão sendo desenvolvidos com objetivo de produzir diferentes
                                                      produtos químicos e/ou melhorar outros produtos como bioetanol de 2a geração, nas indústrias
                                                      de alimentos, panificação, bebidas, têxtil e de papel e celulose. Nesse contexto, o objetivo
                                                      deste trabalho foi a purificação e caracterização bioquímica de uma β-glucosidase de H. brevis
                                                      var. thermoidea. A enzima β-glucosidase foi purificada até a sua homogeneidade após 4
                                                      passos cromatográficos, onde apresentou um rendimento final de 17% e um fator de
                                                      purificação de 362,7 vezes. A massa molecular estimada por SDS-PAGE foi de 125kDa. A
                                                      enzima demonstrou-se resistente a temperaturas mais altas, apresentando a atividade máxima
                                                      entre 60 e 65oC e declínio após este ponto, apresentou meia-vida após 3 horas a 60oC e
                                                      manteve-se praticamente estável a partir deste ponto até 8 h. Além disso, os parâmetros
                                                      avaliados indicam que esta enzima tem sua atividade ótima em pH 5,0 sendo praticamente
                                                      estável a um pH de 2,5 a 8,0. A maioria dos íons, agentes redutores e quelantes, estimularam a
                                                      atividade da enzima. Os resultados demonstram que H. brevis pode ser um candidato a
                                                      contribuir para o conhecimento das propriedades de uma enzima com grande potencial de
                                                      aplicação biotecnológica.
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                                                        Bioprospecção de Fungos Filamentosos do Pantanal Sul Mato-Grossense Produtores de Moléculas Indutoras de Crescimento em Plantas
                                                        Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                        Tipo Dissertação
                                                        Data 06/03/2020
                                                        Área BIOLOGIA GERAL
                                                        Orientador(es)
                                                        • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                        Coorientador(es)
                                                          Orientando(s)
                                                          • Rodrigo Mattos Silva Galeano
                                                          Banca
                                                          • Bianca Obes Correa
                                                          • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                          • Maria Rita Marques
                                                          • Marivaine da Silva Brasil Mansur Cardoso
                                                          Resumo Os fertilizantes e agrotóxicos são utilizados há muito tempo como estratégias para o
                                                          aumento de produtividade agrícola. Entranto, o uso excessivo desses insumos
                                                          causam impactos negativos ao meio ambiente. Uma alternativa sustentável para
                                                          minimizar esse prejuízo é o uso de fungos filamentosos com mecanismos para
                                                          promoção de crescimento vegetal como biofertilizantes, minimizando os impactos
                                                          causados por estes agroquímicos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi prospectar
                                                          fungos filamentosos do Pantanal Sul Mato-Grossense produtores de moléculas
                                                          indutoras de crescimento de plantas. Neste estudo, a capacidade de 60 isolados de
                                                          produzir o AIA foi o primeiro critério de seleção para os estudos posteriores deste
                                                          trabalho. Em seguida, sete isolados foram escolhidos para analisar a produção do
                                                          molécula em diferentes parâmetros físico-químicos, produção de sideróforos e
                                                          atividade solubilizadora de fosfato. Os cinco isolados com maior potencial
                                                          solubilizador de fósforo, foram analisados em relação a produção de amônia, ACC
                                                          deaminase, HCN, hidrolases e proteases. O isolado mais promissor foi escolhido para
                                                          testes de antibiose, identificação molecular e avalição do efeito da inoculação em
                                                          feijão. A partir dos resultados obtidos, o isolado Aspergillus sp. 9-P foi escolhido pois
                                                          apresentou os mecanismos diretos (AIA, sideróforos, solubilização de fosfato, ACC
                                                          deaminase) e indiretos (amônia, hidrolases e proteases, exceto HCN) para promoção
                                                          de crescimento vegetal. Na antibiose, o isolado apresentou bom antagonismo contra
                                                          Fusarium solani e Rhizoctonia sp. A identificação molecular mostrou alta similaridade
                                                          do isolado com Aspergillus niger. Finalmente, a inoculação em feijão proporcionou
                                                          efeitos benéficos na altura, massa fresca e seca da parte aérea e raiz das plantas de
                                                          feijão em relação ao tratamento sem inoculação. Portanto, o isolado Aspergillus niger
                                                          9-P parece ser um ótimo candidato para a formulação de biofertilizantes visando a
                                                          promoção de crescimento vegetal na agricultura.
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                                                            Avaliação do potencial anti-Trypanosoma cruzi de protolimonoides isolados de Guarea kunthiana A. Juss. (Meliaceae)
                                                            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                            Tipo Dissertação
                                                            Data 28/02/2020
                                                            Área BIOLOGIA GERAL
                                                            Orientador(es)
                                                            • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                                            Coorientador(es)
                                                              Orientando(s)
                                                              • Letícia Alves da Cruz
                                                              Banca
                                                              • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                                              • Carlos Eurico dos Santos Fernandes
                                                              • Fernanda Rodrigues Garcez
                                                              • Maria Carolina Silva Marques
                                                              Resumo A doença de Chagas é uma doença infecciosa causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi.
                                                              Anualmente, são registrados cerca de oito milhões de casos de infecção por T. cruzi e dez mil
                                                              mortes, em decorrência das complicações da doença. O único tratamento disponível, que
                                                              consiste na administração do benzonidazol, provoca inúmeras reações adversas aos pacientes,
                                                              além de ser frequentemente pouco eficaz na fase crônica da doença. Nessa perspectiva, destaca-
                                                              se a importância de mais estudos a fim de evidenciar novos compostos com atividade anti-T.
                                                              cruzi, gerando novas possibilidades para o tratamento da doença. Diante disso, realizamos uma
                                                              investigação química dos frutos de Guarea kunthiana, guiado pelo efeito contra as formas
                                                              epimastigotas de T. cruzi (Dm28c). O estudo químico das fases ativas resultou no isolamento
                                                              dos protolimonoides melianona e 3β-O-tigloilmelianol da fase hexânica, e melianodiol,
                                                              melianotriol, melianol e 3β-O-tigloilmelianotriol da fase diclorometânica. Aqui, mostramos
                                                              pela primeira vez o efeito promissor dos seis protolimonoides isolados de G. kunthiana contra
                                                              as três principais formas celulares do parasita e descrevemos um possível mecanismo de ação
                                                              dos compostos sobre as formas replicativas de T. cruzi. Com relação ao efeito sobre as formas
                                                              epimastigotas e tripomastigotas destacaram-se os protolimonoides que possuem grupo hidroxila

                                                              em C-3, enquanto que, em relação às formas amastigotas, o composto com grupo tigloil em C-
                                                              3 e ligação epóxido em C-24/25 provocou maiores danos sobre o crescimento intracelular. A

                                                              incubação das formas replicativas de T. cruzi com os protolimonoides resultou, principalmente,
                                                              na desintegração do kDNA, inchaço e circularização da membrana mitocondrial. Os danos
                                                              funcionais na mitocôndria foram confirmados por citometria de fluxo com Rodamina 123.
                                                              Portanto, sugerimos que os danos estruturais e funcionais na mitocôndria dos parasitas podem
                                                              explicar o notável efeito antiproliferativo dos protolimonoides sobre T. cruzi. Em adição,
                                                              mostramos alterações ultraestruturais associadas ao grupo em C-3 dos compostos, por exemplo,
                                                              a desestruturação do aparelho de Golgi nas formas epimastigotas, observadas apenas na
                                                              presença dos protolimonoides com grupo tigloil em C-3, sugerindo mecanismos de ação
                                                              possivelmente distintos entre os compostos. Nossos resultados mostram a potencialidade dos
                                                              protolimonoides como agente antiparasitário, representando uma alternativa promissora no
                                                              desenvolvimento de novas drogas contra infecção por T. cruzi.
                                                              Atividade antimicrobiana e o mecanismo de ação de um peptídeo sintético contra bactérias patogênicas
                                                              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                              Tipo Dissertação
                                                              Data 20/02/2020
                                                              Área BIOLOGIA GERAL
                                                              Orientador(es)
                                                              • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                                                              Coorientador(es)
                                                                Orientando(s)
                                                                • Claudiane Vilharroel Almeida
                                                                Banca
                                                                • Douglas Chodi Masui
                                                                • Janaina de Cassia Orlandi Sardi
                                                                • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                                                                • Simone Maria Neto
                                                                Resumo A disseminação de cepas bacterianas resistentes aos antibióticos de uso
                                                                convencional é um dos principais problemas de saúde mundial. Os peptídeos
                                                                antimicrobianos (PAMs) têm sido considerados uma das alternativas para o controle
                                                                de infecções bacterianas. Apresentam atividade em amplo espectro e a capacidade
                                                                de eliminar células-alvo rapidamente. Este trabalho teve por objetivo caracterizar a
                                                                estrutura de um PAM obtido através do desenho com auxílio computacional,

                                                                determinar seu mecanismo de ação contra bactérias patogênicas. Parâmetros físico-
                                                                químicos e estruturais foram previamente projetados através de ferramentas

                                                                computacionais. Após síntese química, a concentração inibitória mínima (CIM),
                                                                concentração bactericida mínima (CBM) e a atividade antibiofilme foram avaliadas. A
                                                                estrutura secundária na presença de água e condições que mimetizam as membranas
                                                                biológicas foi obtida por dicroísmo circular (CD) e o teste de atividade citotóxica in vitro

                                                                e in vivo foi realizado. O peptídeo catiônico e anfipático desenhado, denominado RQ-
                                                                18, contém 18 resíduos de aminoácidos de comprimento e mostrou atividade

                                                                antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. A CIM para
                                                                Escherichia coli foi de 2 μM e CBM de 5 μM. Em contraste, Staphylococcus
                                                                saprophyticus sofreu efeito bactericida no mesmo CIM (2 μM). A atividade peptídica
                                                                contra isolados de E. coli causadores de infecções bovinas também foi analisada,
                                                                mostrando ação bactericida na concentração de 6 μM. O peptídeo também foi capaz
                                                                de inibir o crescimento de biofilme da cepa resistente a carbapenemase E.coli em
                                                                concentração a 3,7 μM. Ensaios de extravasamento celular e de captação de cristal
                                                                violeta indicam que a atividade antimicrobiana pode ser mediada por danos na
                                                                membrana bacteriana. O RQ-18 apresentou ausência completa de citotoxicidade dos
                                                                fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5), em células vero (CCL-81), em eritrócitos
                                                                e no ensaio in vivo com Corcyra cephalonica, demonstrando ser seguro. Finalmente,
                                                                análises de CD mostraram que o RQ-18 assumiu uma estrutura aleatória na água.
                                                                Caso contrário, TFE (50%) e SDS (30 mM) induzem uma conformação helicoidal. Em
                                                                resumo, RQ-18 representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de um
                                                                novo agente antimicrobiano para ajudar na diminuição da infecção por resistência aos
                                                                antibióticos.
                                                                Página 2 de 3 (20 de 49 registros).